Verspreiding, ecologie en behandeling van rhizogene agrobacteria, oorzaak van gekke wortels bij hydroculturen

Promovendus/a: Lien Bosmans

Promotor(en): Prof. dr. ir. Hans Rediers, Prof. dr. ir. Bart Lievens, Prof. dr. ir. René De Mot

Rhizogene Agrobacterium biovar 1 bevat een wortel-inducerend plasmide (Ri) en veroorzaakt de zogenaamde “gekke wortel ziekte” in de hydrocultuur van tomaat, komkommer en aubergineplanten. Deze ziekte wordt gekarakteriseerd door een enorme wortelontwikkeling wat leidt tot voornamelijk vegetatieve groei van de plant, een lagere opbrengst en bijgevolg ernstige economische verliezen. De algemene doelstelling van deze doctoraatsstudie bestond erin de ecologie van rhizogene agrobacteriën te bestuderen en op zoek te gaan naar een duurzame bestrijding van de gekke wortel ziekte.

Om een beter beeld te krijgen van deze plantpathogeen, werd in een eerste deel van dit werk de genetische en fenotypische variatie tussen verschillende Agrobacterium biovar 1 stammen onderzocht. Een cultuurcollectie van 41 isolaten werd onderworpen aan een aantal fenotypische testen en een multilocus sequentie analyse (MLSA). Hierbij werd de partiële DNA-sequentie van vier huishoudgenen (16S rRNA gen, recA, rpoB en trpE) en twee plasmidegenen (rolB en virD2) bepaald en vergeleken voor de verschillende stammen. Naast een grote fenotypische variatie (bv. sterk verschil in biofilmvorming en groeiparameters, katalase-positieve en katalase-negatieve stammen) werd een opmerkelijke genotypische variatie vastgesteld bij een aantal huishoudgenen, en in het bijzonder voor het chromosomaal gen trpE, dat codeert voor anthranilate synthase E. De variatie voor de plasmide genen was veel kleiner, wat aangeeft dat de chromosomale genen niet dezelfde evolutionaire geschiedenis hebben doorgemaakt als de plasmide genen. Daarnaast toonde deze genetische analyse aan dat minstens vier verschillende genomospecies van Agrobacterium (G1, G3, G8 en G9) in de teelt van groenten op hydrocultuur voorkomen.

Om deze plantpathogeen accuraat te kunnen detecteren, identificeren en kwantificeren, werd vervolgens een specifieke SYBR-Green-gebaseerde qPCR detectietest ontwikkeld. De test werd ontwikkeld op basis van alle rolB sequenties die op het moment van de studie beschikbaar waren zijn en gevalideerd door middel van een groot aantal doelwit en niet-doelwit stammen, en vertoonde een zeer hoge specificiteit voor rhizogene Agrobacterium biovar 1 stammen. Verder werd een kalibratiecurve opgesteld op basis van artificieel gecontamineerd water waarmee het aantal rhizogene agrobacteriën in praktijkstalen nauwkeurig kan bepaald worden. De detectielimiet van de test werd vastgesteld op 1 cel per mililiter water.

Naast het stellen van een accurate diagnose is er dringend nood aan een efficiënte bestrijding van de pathogeen, wat sterk bemoeilijkt wordt doordat rhizogene agrobacteriën in staat zijn om biofilms te vormen in het irrigatiesysteem. Daarom werd in een volgend deel de efficiëntie onderzocht van het gebruik van waterstofperoxide om rhizogene Agrobacterium biovar 1 te bestrijden (zowel in biofilm als onder de vorm van planktonische cellen). Waterstofperoxide wordt veelvuldig gebruikt in de sector om plantpathogenen in irrigatiesystemen te bestrijden, maar haar doeltreffendheid voor rhizogene agrobacteriën was nog niet gekend. In laboratoriumexperimenten vonden we een grote variatie aan EC50-waardes voor waterstofperoxide (18.8 tot >600 ppm waterstofperoxide). Experimenten met een pilootopstelling toonden aan dat 25 ppm waterstofperoxide niet volstaat om rhizogene agrobacteriën in biofilm af te doden. Een behanding met 50 ppm waterstofperoxide bleek wel effectief voor de bestrijding van katalase-negatieve stammen. Een behandeling van 100 ppm waterstofperoxide was nodig om biofilms met katalase-positieve agrobacteriën af te breken. Een experiment onder praktijkcondities tenslotte toonde aan dat toegediende waterstofperoxide concentraties daalden naar het einde van de irrigatieleidingen toe. Verder werd een duidelijke correlatie gevonden tussen de actuele waterstofperoxide concentratie en de incidentie van gekke wortels.

Een nadeel van de meeste chemische desinfectiemiddelen is dat ze aanleiding kunnen geven tot de vorming van toxische bijproducten, die schadelijk zijn voor mens en milieu. Daarom hebben we ons in een laatste hoofdstuk gericht op biologische controle. Een uitgebreide collectie met diverse bacteriën werd gescreend op antagonistische activiteit tegen rhizogene agrobacteriën door een “agar-overlay assay” te gebruiken. Van de meer dan 150 geteste bacteriestammen vertoonde alleen een groep van fylogenetisch verwante Paenibacillus stammen antagonistische activiteit, waaronder de soorten P. illinoisensis, P. pabuli, P. taichungensis, P. tundrae, P. tylopili, P. xylanexedens en P. xylanilyticus. Een studie van het activiteitsspectrum toonde aan dat bepaalde stammen antagonistische activiteit vertoonden tegen alle geteste rhizogene agrobacteriën, terwijl andere stammen enkel actief waren tegen een deel van de geteste stammen. Preliminaire karakterisering van de antagonistische componenten van twee verwante Paenibacillus stemmen (geïdentificeerd als P. xylanexedens) toonde aan dat deze wateroplosbaar zijn en een laag moleculair gewicht hebben. Toepassing van een combinatie van beide stammen onder praktijkcondities resulteerde in een significante reductie van het aantal tomatenplanten besmet met gekke wortels, wat suggereert dat deze bacteriecombinatie veelbelovend is om rhizogene agrobacteriën te beheersen.

Samengevat werd er in deze doctoraatsthesis nieuwe kennis opgebouwd rond rhizogene Agrobacterium biovar 1, met een belangrijke focus op genetische en fenotypische diversiteit, werd een betrouwbare kwantitatieve detectiemethode ontwikkeld en werden nieuwe strategieën ontwikkeld voor chemische en biologische controle. Al deze aspecten zullen ongetwijfeld bijdragen tot een duurzame bestrijding van gekke wortels in de hydrocultuur van tomaten, komkommers en aubergines.