Nontoxic Clostridium botulinum strains as tools for food safety research and sources of novel bioproducts

Promovendus/a: Marijke Poortmans

Promotor(en): Prof. dr. ir. Christiaan Michiels

Clostridium botulinum is gekend voor de productie van het meest krachtige gekende natuurlijke toxine dat verlamming veroorzaakt (botulisme). Consumptie van producten waarin groei en toxine-vorming is opgetreden, kan aanleiding geven tot voedingsbotulisme, en desondanks de lage incidentie is C. botulinum toch een erg belangrijke pathogeen omdat deze als referentie geldt voor het ontwerp van veilige formuleringen, verhittingsprocessen en bewaarcondities van voedingsmiddelen. De soort bestaat uit bacteriën die botulinum toxine (BoNT) produceren, maar is verder erg heterogeen, en wordt onderverdeeld in vier groepen op basis van het geproduceerde toxinetype en genetische en fysiologische kenmerken. Enkel groep I en II veroorzaken humaan botulisme. De groep I stammen vormen sporen met de hoogste gekende hitte resistentie van alle voedselpathogenen, en groep II stammen zijn dan weer gekend om hun groei en toxine productie in gekoelde voedingsmiddelen bij temperaturen tot 3°C. Bijgevolg treedt het grootste botulismerisico op in niet-zure conserven die bewaard worden op kamertemperatuur en mild behandelde producten die niet of slecht gekoeld worden voor groep I stammen, en in gekoelde, mild behandelde producten voor groep II stammen. Consumenten en producenten streven voortdurend naar voedingsmiddelen die minder intens behandeld zijn, minder zout, suiker en artificiële bewaarmiddelen bevatten, maar die toch lang houdbaar zijn, en dit stimuleert de ontwikkeling van nieuwe formuleringen, ingrediënten en procestechnieken. Belangrijk hierbij is om de microbiologische veiligheid steeds te garanderen, en daarom zijn provocatietesten (challenge testen) met voedselpathogenen vaak vereist om de veiligheid van nieuwe producten te valideren. Helaas zijn dergelijke testen met C. botulinum erg gevaarlijk en worden ze extra bemoeilijkt door het gebrek aan een selectief medium om deze bacteriën te tellen. De hoge toxiciteit is daarnaast ook een rem op het fundamenteel onderzoek naar de ecologie en fysiologie van C. botulinum. Om al deze redenen beoogde dit doctoraatswerk de isolatie en karakterisatie van natuurlijke atoxigene stammen van groep I en II C. botulinum, en de ontwikkeling van een methodologie voor meer toegankelijke challenge studies gebruik makend van deze stammen als surrogaat.

Tweeëntwintig atoxigene group I en 16 atoxigene groep II stammen werden geïsoleerd en grondig gekarakteriseerd op zowel fenotypisch als op genotypisch niveau. Binnen groep I en groep II werden stammen geïdentificeerd met een hoge groeitolerantie voor zout, zuur en lage temperatuur, en die sporen vormden met hoge hitteresistentie, en deze stammen werden uitgerust met een erythromcyine merker in een structureel gen van een onvolledige profaag. Om de kwantitatieve telling van deze stammen mogelijk te maken werd daarnaast een selectief uitplaatmedium ontworpen dat naast erythromycine (Em) ook cycloserine (Cs) en gentamicine (Gm) bevatte (en ook lysozyme voor de groep II stammen). Ter validatie van de stammen en het medium werd een provocatietest opgezet met een cocktail van drie atoxigene gemerkte groep I stammen in een nitrietvrije gefermenteerde worst. Dit onderzoek toonde aan dat er weinig of geen groei of sporenkieming van de groep I stammen plaatsvond in het product, zelfs niet in het worst-case scenario waarbij er een trage en slechts gedeeltelijke verzuring optrad. Deze resultaten suggereren dat nitriet niet noodzakelijk is voor de controle van C. botulinum in dit soort producten. De surrogaatstammen werden verder gebruikt om de effectiviteit van vier alternatieve bewaarmiddelen (Hop β-zuren (HBA), lauroyl ethyl arginaat (LAE), natrium diacetaat en natrium lactaat) te onderzoeken om de groei van vegetatieve cellen en de kieming van sporen te inhiberen. Er werd aangetoond dat alle geteste componenten de sporenkieming inhibeerden bij concentraties die gelijk of zelfs lager lagen dan de minimaal inhibitorische concentratie (MIC) ten opzichte van vegetatieve cellen. De vier componenten werden ook getest in een complex voedingsmiddel (vol-au-vent) geïnoculeerd met een cocktail van vier groep II surrogaatstammen en bewaard bij lage temperatuur, maar hun antimicrobiële activiteit bleek in deze matrix veel zwakker dan in het eerder gebruikte groeimedium, en de gebruikte concentraties konden sterke uitgroei van het inoculum na één tot twee weken niet verhinderen. Tot slot werden twee nieuwe sactipeptiden die geproduceerd worden door één van de atoxigene groep I stammen en die sterke antimicrobiële activiteit vertoonden tegen andere Clostridium soorten, beschreven in dit werk, en aangeduid met de naam clostisactines. De masterregulator voor sporulatie, Spo0A, bleek de expressie van de clostisactines te reguleren, en er werd ook aangetoond dat de peptiden een celdodende werking hebben. Microscopische analyse suggereert dat de peptiden de gevoelige cellen binnendringen, waarna ze interfereren met een nog te identificeren intracellulair doelwit waardoor groeistilstand optreedt, gevolgd door permeabilisatie van de celmembraan en tenslotte celdood.

Er wordt verwacht dat de inzichten die werden verworven en de tools die werden ontwikkeld in dit werk een bijdrage kunnen leveren tot innovatie in de voedingsindustrie en tot basisonderzoek naar C. botulinum.