Structure of the protein phosphatase PP1 interactors Sds22 and NIPP1

Promovendus/a: Ewald Heroes

Promotor(en): Prof. dr. Luc Van Meervelt, Prof. dr. Mathieu Bollen

ACHTERGROND

De functie van ongeveer een derde van alle proteïnen in onze cellen wordt gecontroleerd door fosforylering door specifieke proteïne kinasen. Het is dan ook niet verwonderlijk dat proteïne kinasen het doelwit zijn van talrijke medicijnen. De meeste fosforyleringen zijn omkeerbaar via defosforylering door een specifiek proteïne fosfatase. Eén van de meest voorkomende proteïne fosfatasen is PP1 (Proteïne fosfatase 1). Dit enzym is verantwoordelijk voor ongeveer een derde van alle defosforyleringen in de cel en speelt zo een rol in heel wat processen. De multifunctionaliteit van PP1 is mogelijk doordat het kan binden met een 200-tal verschillende activiteit- en substraatbepalende proteïnen, ter vorming van een PP1-holoënzym. Een innovatieve therapeutische aanpak kan er dus in bestaan zich te richten op specifieke PP1-holoënzymen, bijvoorbeeld door interferentie met de rekrutering van specifieke PP1-bindingspartners.

DOELSTELLING

Dit project kadert in een samenwerking tussen het Laboratorium Biomoleculaire Architectuur (Departement Chemie, K.U. Leuven) en het Laboratorium voor Biosignalering en Therapeutica (Departement Moleculaire Celbiologie, K.U. Leuven). Laatstgenoemde heeft een expertise opgebouwd in de structurele en functionele karakterisering van PP1-holoënzymen. Uit dit onderzoek werden enkele PP1-holoënzymen geselecteerd met een therapeutisch hoog potentieel, waaronder het Sds22/I3-PP1 complex. Onderzoek toont aan dat dit PP1-holoënzym een essentiële rol speelt in de vervollediging van de celdeling. Daarnaast is geweten dat ook de inactivering van PP1 door fosforylering hierin essentieel is. Deze data identificeren het Sds22/I3-PP1 complex en gefosforyleerde PP1 als beloftevolle doelwitten in de behandeling van kanker. Het doel van dit project is om de gedetailleerde 3D-structuur van Sds22 en I3, al dan niet in complex met PP1, en gefosforyleerde PP1 te bepalen. Op basis van deze kennis kunnen cruciale interactiesites binnen deze proteïnen en structuur-functie relaties achterhaald worden. Op termijn kan deze kennis dan opgepikt worden door farmaceutische bedrijven om een zoektocht te starten naar kleine organische moleculen die interfereren met de Sds22-PP1 en/of I3-PP1 interactie of met de inactivering van PP1 en hieruit nieuwe therapeutica te ontwikkelen. Op die manier zal dit project bijdragen tot de ontwikkeling van de farmaceutische industrie in Vlaanderen en tot het welzijn en de gezondheid van ieder mens.

METHODIEK

De structuur van de proteïnen zal bepaald worden door middel van X-stralenkristallografie. Dit zal uitgevoerd worden in drie stappen:

(1) Bacteriële (co-)expressie van het proteïne (of proteïnecomplex), opzuivering (affiniteitschromatografie, ionuitwisselingschromatografie, gelfiltratie) en  kwaliteitscontrole (massaspectrometrie)  

(2) (Co-)kristallisatie met gebruik van kristallisatierobots (TECAN Freedom EVO 150/8 en Mosquito Nanodrop) en door middel van de ‘sitting drop’ en ‘hanging drop’ dampdiffusie-techniek

(3) Datacollectie (Bruker SMART 6000 diffractometer, synchrotron-‘beamlines’)

en -verwerking (moleculaire verplaatsing, ‘SAD-phasing’)

ONDERZOEKSGROEPEN

De eerste stap zal uitgevoerd worden in het Laboratorium voor Biosignalering en Therapeutica. De tweede en derde stap zullen plaatsvinden in het Laboratorium Biomoleculaire Architectuur, binnen het kader van BioMacS, het K.U. Leuven Interfacultaire Centrum voor Biomacromoleculaire Structuur.