Understanding Saccharomyces cerevisiae invertase activity and specificity in the context of breadmaking

Promovendus/a: Jitka Laurent

Promotor(en): Prof. dr. ir. Christophe Courtin , Prof. dr. ir. Kevin Verstrepen

Saccharomyces cerevisiae invertase (ScInv) is een β-fructofuranosidase dat wordt gecodeerd door verschillende, nauw verwante SUC-genen en wordt ingedeeld in de familie 32 van de glycoside hydrolasen. ScInv geeft de voorkeur aan sucrose als substraat, maar kan daarnaast ook raffinose, fructo-oligosacchariden (FOS) en korte keten fructanen hydrolyseren. Invertase, geproduceerd door de bakkersgist, speelt een belangrijke rol tijdens de broodbereiding. Zo is dit enzym verantwoordelijk voor de vrijzetting van suikers waaruit het grootste deel CO2 geproduceerd wordt tijdens de eerste uren van het fermentatieproces. Ondanks het belang van invertase tijdens de broodbereiding en verschillende andere industriële processen, is er slechts weinig geweten over zowel de variabiliteit in ScInv activiteit en specificiteit als de factoren die deze variabiliteit bepalen. Het voornaamste doel van dit doctoraatsonderzoek was dan ook meer inzicht te krijgen in de activiteit en specificiteit van ScInv zoals aanwezig in gist, en dus niet gewoon als opgezuiverd enzym. Deze nieuwe inzichten zouden gebruikt kunnen worden voor de ontwikkeling van gist-gebaseerde strategieën om de hydrolyse van fructaan tijdens de broodbereiding te moduleren.

Een set van 28 industriële S. cerevisiae stammen werd geanalyseerd op invertase-activiteit en -specificiteit. Deze stammen vertoonde een hoge variabiliteit in invertase-activiteit ten opzichte van sucrose en FOS. De variabiliteit in FOS specificiteit was echter minder uitgesproken. Een vergelijking van 29 verschillende SUC allelen toonde een gelijkenis aan van 89 tot 100%. De fylogenetische stamboom vertoonde drie verschillende groepen van SUC allelen, wat wijst op een zekere variabiliteit in SUC gen sequenties. Verdere experimenten toonden aan dat kleine sequentieverschillen een invloed kunnen hebben op de activiteit en specificiteit van ScInv voor sucrose, FOS en langere fructosepolymeren. Ook andere factoren die ScInv activiteit en specificiteit kunnen beïnvloeden werden onderzocht. Er kon geen duidelijke correlatie waargenomen worden tussen invertase-activiteit en de ploïdie van giststammen, noch tussen invertase-activiteit en het aantal SUC genen. De impact van de industriële herkomst van de giststammen op hun invertase-activiteit was daarentegen meer uitgesproken. Verder werd er waargenomen dat de ScInv invertase-activiteit stijgt met een toenemende temperatuur tot er een optimum werd bereikt rond 60°C. Bovendien resulteerden hogere incubatietemperaturen in een hogere FOS specificiteit, waarschijnlijk als gevolg van een hogere moleculaire mobiliteit in het enzym.

Het gebruik van de variabiliteit in ScInv activiteit en specificiteit bleek een eenvoudig en effectief middel om de hydrolyse van fructaan tijdens de broodbereiding te moduleren. Stammen met een hoge invertase-activiteit voor FOS hydrolyseerden tarwefructanen sneller en in grotere mate, wat resulteert in een lager finaal fructaangehalte en dus een lager FODMAP-gehalte in brood. Het gebruik van stammen met een lagere invertase-activiteit kan het gehalte aan fermenteerbare voedingsvezels in brood verhogen, aangezien er minder fructaan wordt afgebroken tijdens de fermentatie. De selectie van giststammen voor het moduleren van fructaanhydrolyse tijdens fermentatie kan ook worden gemaakt op basis van de SUC-gensequentie. De SUC gensequentie van gisten beïnvloedt namelijk hun vermogen om fructaan en sucrose te hydrolyseren tijdens deegfermentatie. Deze verschillen in hydrolyse van fructaan en sucrose kunnen gerelateerd worden met de verschillen in invertase-activiteit en -specificiteit en met verschillen in het vermogen om langere substraten te hydrolyseren. Een andere benadering is om deze inzichten te gebruiken om kleine aanpassingen te maken aan de SUC gensequentie van een bakkersgist, om zo de fructaanhydrolyserende capaciteit te verbeteren of te verminderen. Deze aanpak zorgt ervoor dat dezelfde giststam gebruikt kan worden waardoor de impact op de CO2-productie, de broodtextuur en de smaak beperkt blijft.

In een laatste deel werd de activiteit en specificiteit van Kluyveromyces marxianus inulinase (KmInu) vergeleken met ScInv. De fructosidase-activiteit ten opzichte van sucrose van de stam die INU1 tot expressie brengt, was lager in vergelijking met stammen die SUC allelen tot expressie brengen. De fructosidase-activiteit en -specificiteit voor FOS en gemengde en lange keten inuline waren daarentegen hoger voor stammen die INU1 tot expressie brengen. Verder bleek dat hoe langer het substraat, hoe groter het aandeel van het gesecreteerde enzym in de totale fructosidase-activiteit. Bovendien vertoonde het vrije enzym een ​​hogere specificiteit voor langere substraten, wat verklaard kan worden door de afwezigheid van de celwandbarrière waardoor er een betere toegankelijkheid is voor deze substraten. Ten slotte toonden fermentatie-experimenten aan dat het tot expressie brengen van een INU1 allel in S. cerevisiae een goed alternatief zou kunnen zijn voor het gebruik van K. marxianus tijdens de broodbereiding.

Samengevat heeft deze doctoraatsstudie meer inzicht gegeven in de moleculaire basis voor natuurlijke verschillen in invertase-substraatspecificiteit tussen S. cerevisiae stammen, alsook in de factoren die de activiteit en specificiteit van ScInv beïnvloeden. Dit onderzoek opent dus de deur voor de selectie of het genetisch manipuleren van gisten en Suc-enzymen met specifieke activiteiten die het mogelijk maken om de hydrolyse van fructaan te moduleren. Daarnaast werden er nieuwe gist-gebaseerde strategieën ontwikkeld om de hydrolyse van fructaan tijdens de fermentatie van brooddeeg te moduleren.