Deciphering the impact of the cystic fibrosis lung microenvironment on antibiotic activity

Promovendus/a: Sara Van den Bossche

Promotor(en): Prof. dr. Aurélie Crabbé, Prof. dr. Tom Coenye

Chronische luchtweginfecties met Pseudomonas aeruginosa dragen in grote mate bij tot de morbiditeit
en mortaliteit in patiënten met mucoviscidose. Standaard antibiotica gevoeligheidstesten in het klinisch
laboratorium zijn niet in staat om de werkzaamheid van een antibioticum op een adequate manier te
voorspellen bij mucoviscidose patiënten, waardoor artsen vaak een empirische keuze maken of hun keuze
laten afhangen van de vroegere respons van de patiënt op een behandeling. De beperkt voorspellende
waarde van gevoeligheidstesten is (deels) te wijten aan hun simplistische aard, die in schril contrast staat
met de complexe en geïndividualiseerde micro-omgeving in de luchtwegen van patiënten met
mucoviscidose. Vandaar onderzoekt deze thesis de impact van de micro-omgeving in mucoviscidose
luchtwegen op antibiotica activiteit en doelt deze thesis op het ontwikkelen van in vitro modellen die
beter het succes van een antibiotica behandeling zouden kunnen voorspellen.
Aangezien P. aeruginosa isolaten van één sputumstaal vaak verschillen in fenotype (waaronder antibiotica
gevoeligheid) en gevoeligheidstesten typisch gebeuren op slechts enkele isolaten, werd de impact van
diversiteit binnen één staal op het resultaat van gevoeligheidstesten beoordeeld in het eerste deel van
deze thesis. Hiertoe werden 15 sputumstalen van afzonderlijke mucoviscidose patiënten verzameld en de
gevoeligheid voor drie veelgebruikte antibiotica (aztreonam, ceftazidim en tobramycine) werd bepaald
voor 30 P. aeruginosa isolaten per staal. Diversiteit in gevoeligheid voor minstens één antibioticum binnen
één staal werd gevonden voor 80% van de stalen en was sterk gelinkt aan het optreden van categorische
discrepantie (d.w.z. classificeren van isolaten binnen een andere gevoeligheidscategorie). Gezien de
duidelijke impact van de diversiteit binnen één staal, werd onderzocht of isolaten poolen voor het
uitvoeren van een gevoeligheidstest een geschikte aanpak was om de diversiteit in het resultaat van
gevoeligheidstesten te doen dalen. Isolaten poolen leidde inderdaad tot minder diversiteit in
testresultaten en wanneer negen isolaten werden gepoold, was het testresultaat niet langer divers voor
alle sputum stalen. Bovendien leidde het poolen van negen isolaten in de meeste sputumstalen tot een
daling in het niveau van categorische discrepantie en niet tot een lagere detectie frequentie van
resistentie.
In het tweede deel van deze thesis, onderzochten we de invloed van patiënt-specifieke long microbiota
op antibiotica activiteit, aangezien interacties tussen bacteriën antibiotica activiteit kunnen beïnvloeden.
Hiertoe werd de activiteit van vier antibiotica (tobramycine, colistine, ciprofloxacine en aztreonam)
bepaald in medium dat geconditioneerd was door patiënt-specifieke microbiota (MCM). Dit MCM werd
bekomen door sputum microbiota van tien afzonderlijke mucoviscidose patiënten te isoleren en in vitro
te incuberen in condities gelijkaardig aan mucoviscidose luchtwegen (d.w.z. in lage zuurstofconcentraties
en in synthetisch mucoviscidose sputum medium) en daarna het steriele supernatans te oogsten. De
microbioom samenstelling voor en na incuberen werd vergeleken via metagenomics en de gesecreteerde
metabolieten in MCM werden geïdentificeerd door middel van metabolomics. De meest abundante
bacteriën uit de originele sputum stalen werden ook teruggevonden na incubatie. Medium
geconditioneerd door de levende microbiota veranderde de antibiotica activiteit tegen P. aeruginosa op
een patiënt-specifieke manier, met verschillen tussen antibiotica en tussen stammen van P. aeruginosa.
Clusteren van de patiënten stalen, gebaseerd op de microbiota samenstelling na incubatie, leidde tot de
identificatie van drie verschillende microbiotaprofielen met elk een versterkend effect op de activiteit van
één bepaald antibioticum. De abundantie van metabolieten in MCM werd vervolgens vergeleken tussen
deze clusters en dit resulteerde in de ontdekking van verschillende kandidaat potentiators van
tobramycine, colistine en ciprofloxacine.
In het laatste deel werden belangrijke stappen gezet in de ontwikkeling van in vivo-achtige
luchtwegepitheel modellen, die zouden kunnen gebruikt worden in infectiestudies om de antibiotica
activiteit tegen P. aeruginosa te bepalen. Ten eerste werden in-vivo-achtige 3-dimensionele aggregaten
van cellijnen van bronchiaal epitheel opgekweekt in een rotating wall vessel bioreactor en de expressie
van differentiatie merkers werd nagegaan a.d.h.v immunostaining en confocale microscopie. Ten tweede,
aangezien het nagaan van de leefbaarheid van epitheelcellen tijdens in vitro experimenten rond gastheermicrobe interacties essentieel is, werd de geschiktheid van een veelgebruikt assay voor leefbaarheid (de
lactaat dehydrogenase (LDH) assay) bepaald. Vier van de acht geïncludeerde bacteriën interfereerden met
de resultaten van de LDH assay en het mechanisme van interferentie werd achterhaald. Tot slot werd een
aangepast protocol ontworpen dat toelaat om de LDH assay te gebruiken zonder bacteriële interferentie.
De bevindingen van deze thesis verbreden onze kennis rond de impact van de (patiënt-specifieke) microomgeving in mucoviscidose luchtwegen op antibiotica activiteit en dragen bij tot nieuwe strategieën om
deze (patiënt-specifieke) micro-omgeving op te nemen in in vitro modellen.