Exploring the sequence and functional landscapes of natural and engineered polymerases through directed evolution

Promovendus/a: Paola Mishal Handal Marquez

Promotor(en): Prof. dr. Vitor Bernardes Pinheiro, Prof. dr. Matheus Froeyen, De heer Georgios Gkouridis

De principes van evolutie, namelijk gendiversificatie en natuurlijke selectie, worden in laboratoria nagebootst om eiwitten te ontwikkelen met nieuwe of geoptimaliseerde functies. Deze aanpak, die Directed Evolution wordt genoemd, kan onze kennislacunes omzeilen en de ontdekking van eiwitten met op-maat-gemaakte functies vergemakkelijken. Hoewel Directed Evolution steeds nieuwe eiwitten blijft genereren, blijft het een black box en zijn er nog maar weinig inspanningen verricht om het proces van Directed Evolution te optimaliseren en te begrijpen.

Op het gebied van het ontwerpen van DNA polymerasen, dat gaat over enzymen die instaan voor DNA replicatie en reparatie, is Directed Evolution succesvol geweest in het isoleren van varianten die het mogelijk maken om synthetisch nucleïnezuur (XNA) te synthetiseren, wat verscheidene biotechnologische toepassingen met zich meebrengt. Ondanks tientallen jaren onderzoek, worden polymerasen nog steeds slechts gedeeltelijk begrepen en is hun Directed Evolution niet eenvoudig, wat op hun beurt de ontdekking van efficiënte XNA-polymerasen en hun potentiële revolutionaire impact op de enzymatische synthese en ontdekking van op-XNA-gebaseerde therapieën en biotechnologische hulpmiddelen vertraagt.

Mijn onderzoek was succesvol in het ontwikkelen van protocollen en stappenplannen om de black box van Directed Evolution te verkennen, om polymerase ontwikkeling te versnellen en te optimaliseren. Ik ontwikkelde een workflow voor de automatisering van gendiversificatie, dat de input is voor een Directed Evolution stappenplan, om de constructie van hoogwaardige protein libraries te versnellen. Daarnaast onderzocht ik de effecten van verschillende parameters op een artificiële selectietechniek die onderzoekers kan helpen met betere, geïnformeerde beslissingen te nemen bij het opzetten van Directed Evolution stappenplannen. Ik heb ook verschillende polymerase-varianten geïdentificeerd die in staat zijn tot XNA-synthese, wat bijdraagt aan ons begrip van polymerase-mechanismen.

Daarnaast richt het veld van Directed Evolution zich voornamelijk op het isoleren van de beste mutant, waarbij er enorme hoeveelheden informatie geproduceerd door de experimenten, maar deze worden aan zich voorbij gegaan. Om het volledige potentieel van Directed Evolution te benutten, heb ik een tool ontwikkeld dat de input en output van Directed Evolution-experimenten kan omzetten in een eenvoudige "functionele kaart" van polymerasen die kan worden gebruikt om betere, geïnformeerde beslissingen te nemen in opeenvolgende gendiversificatie- en selectierondes. Deze tool kan worden aangepast voor elk ander eiwit dat wordt onderworpen aan Directed Evolution.

Met dit allemaal samen heeft mijn project bijgedragen aan verschillende aspecten van polymerase ontwikkeling door middel van Directed Evolution, heeft het bijgedragen aan ons begrip van polymerasemechanismen en heb ik een stappenplan gecreëerd die kan worden aangepast om de Directed Evolution van elk eiwit te versnellen en te optimaliseren.